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qPCR常见问题及分析解决办法
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来源：《食品安全导刊》2017年第04期
昆山吉和力仪器有限公司（以下简称“吉和力”）是一家提供专业服务和仪器设备的集成供应商，公司以用户实际需求为导向，提供最合适、性价比最高的仪器，致力于打造一站式服务平台。为了让业内人士对qPCR进行更加深入的了解，吉和力整理了一些相关常见问题，并对这些问题一一进行了解答。
qPCR的英文全称是Real-time Quantitative PCR Detecting System，即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称qPCR。
简单来说，qPCR就是利用荧光信号的变化，实时监测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。而常规的PCR无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时监测。 如何提高RT-PCR反应的灵敏度与特异性？ ①确定模板RNA完整性，无DNA污染； ②RNA模板中不应含有扩增反应抑制剂；
③为了防止模板降解，在反应体系中加入RNase抑制剂RNasin；
④使用适量的模板RNA，模板量太多会降低特异性，太少会导致扩增不出条带或条带太弱；
⑤若模板中有二级结构，可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果； ⑥设计引物时，避免在引物3’端含有互补序列，避免形成内部发卡结构。 避免RNA降解的方法有哪些？
①在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA； ②运用良好无污染技术分离RNA；
③将组织从动物体取出后立刻提取RNA，并将提取好的RNA反转录为cDNA进行低温保存。
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RNA中含有逆转录抑制剂时，怎么处理？
逆转录抑制剂包括：SDS、EDTA、甘油、焦磷酸钠、亚精胺和胍盐，可将对照RNA与样品混合，同对照RNA反应比较产量以检测RNA抑制剂；若对照RNA与样品混合后产量降低，则说明样品中存在逆转录抑制剂，可用70%（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗，以除去抑制剂。
如何减少RNA模板中的二级结构？
①将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性、退火，提高逆转录反应温度；
②温度超过60℃时，不能使用oligo（dT）引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP； ③RT-PCR产物的长度超过1kb时，反应温度需保持在65℃。 RNA中有DNA污染的处理方式
①若是基因组DNA的污染，可使用DNaseI处理RNA，同时设置没有逆转录对照组反应检测DNA污染；
②若是受到外源DNA的污染，可使用抗气雾剂和UDG酶。 qPCR探针设计的一般原则有哪些？
①扩增片段的长度不应太大，一般小于300bp；
②探针不能和任一引物互补，且其长度在保证特异性的前提下尽可能的短，长度不要超过30bp；
②探针的Tm值至少比引物的Tm值高5度；
③探针如用于检测多态位点，多态位点应尽可能靠近探针中部； ④探针5’端不能是碱基G，G对荧光基团有猝灭作用。 无反转录酶情况下，对照RNA仍有扩增结果
①体外转录时不可能将所有DNA模板消除，因而对照组会含有痕量的DNA。建议可将第一链cDNA稀释1：10、1：100、1：1000倍以消除DNA污染造成的影响； ②可能是引物二聚体的条带。
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扩增产物滞留在加样孔中
①可能是由于模板量过高而导致PCR结果产生了高分子量的DNA胶状物，建议将第一链cDNA浓度稀释至100倍再进行二次扩增；
②在二次PCR时，使用的退火温度如果比引物的Tm值低5℃，可将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性。 无Ct信号出现
①反应循环参数不够，一般要在35个循环以上，但是过多的循环次数可增加背景值； ②检测荧光信号的步骤有误。SYBRgreen法（SG法）采用的是72℃延伸时采集荧光信号，taqman法则是在退火结束或延伸结束时进行信号采集；
③引物或探针降解，可用PAGE电泳检测其完整性，若是电泳条带呈弥散状，可考虑重新合成引物或探针；
④模板不足或降解，则可以重新提取核酸模板。 Ct值出现过晚（Ct>38）
①扩增效率低，反应条件不够优化，降低退火温度，增加镁离子浓度； ②反应成分降解或加样量不足； ③PCR产物过长，一般采用80-150bp。 标准曲线线性关系不佳
①加样存在误差，是样品浓度不成梯度； ②标准品出现降解，避免反复冻融； ③引物或者探针设计不佳；
④模板中存在抑制物或模板浓度过高。 溶解曲线存在多个主峰 ①引物设计不够优化；