小麦不同部位蛋白全程研究过程简介
1.1小麦叶片蛋白质组提取
采用TCA／丙酮沉淀一酚／SDS联合抽提法来提取小麦叶片蛋白。参照Wang等 [1]方法，加以改进。取新鲜的小麦叶片1g，液氮中迅速研磨成细粉，加入10mI于一20℃预冷的提取介质[10 TCA(w／V)丙酮溶液+0．2 DTT]，反复颠倒混合，一20℃ 沉淀2 h或过夜；4℃ ，16 000×g离心10 min，弃上清；沉淀用含100mmol／I 醋酸铵的80 甲醇溶液洗1次，80 丙酮洗1次，通风橱内室温干燥10 min；加入10mI 酚／SDS抽提夜[-pH 8．0 Tris饱和酚与SDS缓冲液(30 蔗糖、2 SDS、5 J3一巯基乙醇、0．1mol／[ pH 8．0 Tris—Hc1)1：1}昆合]振荡混匀温育5 min，4℃ ，16 000×g离心10 min，转移上层酚相至一干净新管中，加入5倍体积的冷的含100mmol／I 醋酸铵的甲醇溶液，一20℃ 沉淀4 h或过夜；4℃ ，16 000×g离心lOmin，弃上清液，沉淀用甲醇洗1次，80 丙酮洗1次，通风橱内自然风干，～ 80℃ 冰箱保存备用。 1.2 小麦胚乳蛋白的提取 赵[2]选用TCA-丙酮法，抽穗时选取同一天抽穗挂牌标记，抽穗后10 d取挂牌标记的5个穗，取穗中上部灌浆一致的籽粒，剥去颖壳置于冻存管中-80 ℃保存。取冻存籽粒20粒，用灭菌预冷的剪刀和镊子在预冷的研钵中迅速剥去种皮，切去胚，加0.2% PVP迅速研磨至糊状，悬浮于含0.07% DTT的预冷10%TCA-丙酮，-20 ℃过夜。次日4 ℃ 35 000 r·min-1离心15 min， 弃上清， 将沉淀重悬于80%丙酮，于-20 ℃温浴l h，4 ℃ 16 000 r·min-1离心15 min。沉淀重悬于100% 丙酮，于-20 ℃温浴l h，4 ℃16 000 r·min-1离心15 min。重复此步骤2~4次，倒出上清液，离心管置于冰浴中抽真空15 min至丙酮完全挥发，得到的蛋白为粗蛋白。 1. 双向电泳技术
1.1 小麦叶片蛋白质组双向电泳技术
参照李[3]采用SDS—PAGE和双向凝胶电泳30 mg蛋白粉加入300 FI 水化上样缓冲液(8mol／I 尿素、4 CHAPS、65 mmol／I DTT、0．2V／V BioIyte)，37℃水浴30 min，6℃ ，40 000×g离心30 rain，取上清液，Bradford法测定蛋白浓度 。SDS—PAGE电泳上样量为100 mg，蛋白样品与2×电泳上样缓冲液等体积混合，直接在12 的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，胶体考染口 ，用普通凝胶成像系统(Bio—Rad，美国)采集图像。双向电泳采用BioRad公司电泳系统(Protean IEF cell等电聚焦系统、PR()TEAN 11 xi Cell垂直电泳系统、Mini pro—teanⅢ cell垂直电泳系统)，蛋白上样量为：7 cm胶条200 Fg、17 cm胶条5OO Fg。等电聚焦和向第二向SDS—PAGE的转移参照Bio—Rad操作指南进行。IPG胶条为7、17 cm(pH值3～10、4～7，Bio—Rad)，第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳胶浓度为12 。染色采用胶体考马斯亮蓝染色方法l1 。UMAX Power—I．ook 2100XI 型光密度扫描仪(Bio—Rad，美国)，分辨率设为300dpi采集图像。每种蛋白提取方法的双向电泳进行3次重复。PDQuest 7．4软件(BioRad，美国)对图像进行分析。 2.2 小麦胚乳蛋白的双向电泳 对小麦胚乳采用以下技术进行电泳如赵[4]. 样品被动上样及等电聚焦, 选用17 cm IPG胶条（pH 4~7）。IPG干胶条胶面朝下放入水化液的水代盘中，覆盖一层矿物油以防止等电聚焦时尿素析出，蛋白氧化及产生冷凝水，被动水化14 h 后，置于Bio-Rad 等电聚焦仪中，等电聚焦在20 ℃条件下自动进行，每胶条限流50 μA。等电聚焦参数如下：① 500 V 4 h 除盐；② 1 000 V 1 h 线性上升（Gra）；③ 8 000 V 2.5 h 线性上升（Gra）