1、 试述利用基因工程的技术调控基因表达的主要方法 （1）、基因表达系列分析技术
基因表达系列分析技术是一种以测序为基础定量分析全基因组表达模式的技术，能够直接读出任何一种类型细胞或组织的基因表达信息。其基本原理是根据理论上任何长度超过9-10个碱基的核苷酸片段可代表一种转录产物的特意序列，因此，选择特定的限制性内切酶分离转录产物中这些代表基因特异性的9-10各碱基的核苷酸序列并制成标签连接、克隆测序，根据其占总标签数的比例即可分析其对应编码基因的表达频率。 （2）、RNA选择性剪切机制
RNA的选择性剪切是指用不同的剪切方式(选择不同的剪切位点组合)从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪切异构体的过程。一般将选择性剪切分为如下几类：平衡剪切、5’选择性剪切、3’选择性剪切，外显子遗漏，相互排斥性剪切。可以RT-PCR的方法研究一个基因是否存在选择性剪切。其步骤是：首先以cRNA两端特异性引物或来自不同外显子的引物序列在不同组织来源的RNA样品中进行扩增，观察PCR产物大小是否存在差异。如果发现差异，测序后可以分析出这种差异是否来自于选择性剪切。选择性剪切使一个基因翻译为多种蛋白质序列，是基因表达多样性的重要表现形式。 （3）、原位杂交技术
原位杂交(in situ hybridization,ISH)是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。通常可以分为RNA原位杂交和染色体原位杂交两大类：1、RNA原位杂交用放射性或非放射性(如地高辛、生物素等)标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，就可以通过检测放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物在细胞水平上作出定性定量分析；2、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术首先对于寡核苷酸探针做特殊修饰和标记，然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相偶联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体的位置。FISH技术不需要放射性同位素，实验周期短，检测灵敏度高。 （4）定点突变技术
定点突变是重组DNA进化的基础，该方法通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，常用于研究某个氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。但目前为止选择氨基酸突变的位点存在一定的盲目性。主要是采用两种PCR方法来实现：重叠延伸技术和大引物诱变法在基因序列中进行定点突变。 （5）RNAi技术 RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA，从而阻断体内靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。其过程一般为：在Dicer的参与下，细胞中的双链RNA首先被降解形成21-25个核苷酸的小片段双链RNA(siRNA)，然后又siRNA中的反义链指导合成一种被称为RNA诱导的沉默复合体(RISC)的核蛋白体，再又RISC介导切割目的mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域，从而实现干扰基因表达的功能。同时，siRNA可作为特殊引物，在依赖于RNA的RNA聚合酶的作用下，以目的mRNA为模板合成dsRNA，后者又可被降解为新的siRNA，重新进入上述循环。 (6)一些基本分子生物学手段
在启动子上游构建增强子、细菌培养时加入诱导物诱导产物生成等。 2、论述原核生物和真核生物基因组的异同 1 原核生物的基因组结构特点
1.1 染色体数量少，一般只有一条染色体,即一个核苷酸分子,无细胞核·
1.2 DNA结构特点。大多数为双螺旋结构，少数以单链形式存在，核苷酸大多数为环状,少数为线状·有些细菌有染色体外遗传因子,即质粒DNA。
1.3 基因组小，结构简单，DNA一般只有单一复制起点，基因组中含有数百个至数千个基因，基因组内核苷酸大多数序列用于编码多肽以及tRNA,rRNA等,仅少量的非编码核苷酸序列构成调控元件，基因的编码序列通常是连续的,中间无非编码成分。 1.4 转录单元。原核生物基因组中,功能相关的基因常丛集在基因组的一个或几个特定部位,形成一个功能单位或转录单元，其活性受到同步调控,它们可被转录为多个mRNA分子,叫多顺反子，操纵子是最具典型的模式。
1.5 重叠基因，一些细菌同一段DNA能携带不同的蛋白质信息，即同一段DNA片段能够编码两种甚至三种蛋白质分子。 2 真核生物的基因组结构特点 2.1 染色体数量多,结构复杂·由几个或几十个更多的双链DNA分子组成。存在以核小体为单位的染色质结构,这是原核生物基因不具有的，核小体是绕在4对组蛋白H2A,H2B, H3, H4所组成的八聚体核心外两周,并含有连接区的一个分子的H1组蛋白,整个DNA分子与蛋白质稳定地结合。
2.2 DNA结构特点，都是双链双螺旋结构,核苷酸分子多数为线状，含有原核生物不同的染色体外遗传因子,如有细胞器基因,线粒体DNA等。
2.3 基因组大，结构复杂，DNA有多个复制起点，每个基因组中含有数万个基因。 2.4 重复序列，大致分为:
单拷贝序列·基因组中只有一个拷贝,占基因组的40%~70%；
少量重复序列·每一种序列的重复次数大约2~10拷贝·组成串联重复基因；
中度重复序列·这些序列一般是分散的,每一种序列的重复次数大约十个到数百个拷贝； 高度重复序列·这些序列一般是不分散的,大部分集中在异染色体中,特别是在中心粒和端粒的附近。比如卫星DNA。
2.5 基因家族。真核基因都是单顺反子，即一个结构基因转录一个mRNA分子、翻译一条多肽链，许多功能相关的基因成套组合,形成基因家族。
2.6 断裂基因。真核生物无操纵子,基因是不连续的,同一基因的编码序列被数量不等的非编码间隔隔成多个较小的片段,编码蛋白的片段叫外显子(exon),非编码蛋白的片段叫内含子(intron)，内含子虽然不被翻译,但特定的核苷酸序列对RNA的精确剪接加工是不可缺少的。
3、
论述原核生物和真核生物基因表达调控的异同
总体来说，真核生物基因组大,染色体数量多,且结构复杂,存在基因家族和断裂基因；原核生物基因组小,染色体数量少,结构简单,有重叠基因和操纵子结构，基因表达调控可以在复制、扩增、基因激活、转录、转录后、翻译和翻译后等多级水平上进行,但转录水平调控是主要的。如何实施调控,二者差距明显。真核生物,激素水平和发育阶段是基因表达调控的主要手段,而营养条件和环境因素的影响力大为下降。真核基因表达以正性调控为主导，基因的转录与染色质的结构变化相关,真核基因转录发生在细胞核(线粒体基因的转录在线粒体内),需对内含子精确剪接加工，翻译则多在胞浆,两个过程是分开的。基因表达调控的环节比原核生物更多。原核生物中,营养条件和环境因素对基因表达调控起举足轻重的作用，mRNA在形成过程中与核糖体混合在一起,如细菌。所以细菌的转录和翻译几乎发生在同一时间间隔内,转录和翻译相耦联。 详细分析其特点如下：
原核生物的基因表达调控特点 1.转录水平的调控
无论原核生物还是真核生物的基因调控主要是转录水平的,原核生物不同于真核生物的基因结构,存在转录单元,即操纵子，原核生物的转录受操纵子控制。 1.1 RNA聚合酶与启动子的影响
DNA转录RNA合成起始时,只有带有σ因子的全酶才能专一地与DNA上的启动子结合，σ因子能提高酶辨认启动子的能力，若启动子与聚合酶结合紧密,则基因获得较高水平的转录,否则,转录水平较低，另外,还发现有些基因有增强子，位于转录起始的上游,是强化转录起始的序列。
1.2 代谢产物的调控
可诱导调节：在代谢产物或化合物的诱导下,使基因活化,操纵子由关闭状态转为工作状态，如大肠杆菌的乳糖操纵子：无诱导物存在时，阻遏物与操作基因结合使得结构基因不能正常转录；诱导物（乳糖或IPTG）存在，与阻遏物结合时，阻遏物从操纵基因上脱离下来，RNA聚合酶便可通过启动子和操作基因正常转录出一条多顺反子mRNA从而翻译得到三种酶。
可阻遏调节：基因转录平时是开启的,但由于某些特殊代谢产物或化合物的积累将其关闭,阻遏基因的转录,不能合成蛋白质或酶。如大肠杆菌的色氨酸操纵子：trp操纵子转录起始的调控是通过阻遏蛋白实现的。产生阻遏蛋白的基因是trpR，它结合于trp 操纵基因特异序列,阻止转录起始。当Trp 水平低时,阻遏蛋白以一种非活性形式存在,不能结合DNA。这时 Trp 生物合成途径被激活；trp操纵子转录终止的调控是通过弱化作用实现的。在大肠杆菌trp operon,前导区的碱基序列包括4个分别以1、2、3和4表示的片段,能以两种不同的方式进行碱基配对, 1 - 2和3 -4配对,或2 - 3配对, 3 - 4配对区正好位于终止密码子的识别区。前导序列有相邻的两个色氨酸密码子,当培养基中Trp 浓度很低时,负载有Trp 的tR2NATrp也就少,这样翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就会很慢,当4区被转录完成时,核糖体滞留1区,这时的前导区结构是2 - 3配对,不形成3 - 4配对的终止结构,所以转录可继续进行。反之,核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子,在4区被转录之前,核糖体就到达2区,这样使2 - 3不能配对, 3 - 4 区可以配对形成终止子结构, 转录停止。 1.3 降解物对基因转录的调节
细菌在有葡萄糖存在的培养基情况下,即使加入乳糖、半乳糖等诱导物,与其相应的操纵子也不会启动，这是由于葡萄糖抑制了细菌的腺苷酸环化酶,减少环腺苷酸(cAMP)的合成。当 培养基中的葡萄糖减少时,则环腺苷酸的活力提高, cAMP的合成增加, cAMP与CRP形成复合物并与操纵子结合,促进乳糖的表达。降解物的抑制作用是通过促进基因转录来正常调节基因表达的。
1.4 细菌的应急反应对基因表达的调控
细菌在生存条件危急时,如氨基酸全面匮乏,细菌会产生一个应急反应:包括生产各种RNA、糖、脂肪、蛋白质在内的几乎全部生物化学反应过程均被停止，因为此时细菌细胞中存在大量不载氨基酸的tRNA,空载的tRNA激活焦磷酸转移酶,使鸟苷四磷酸(ppGpp)大量合成, ppGpp的出现会关闭许多基因·除ppGpp外,实施应急反应的额信号还有鸟苷五磷酸(pppGpp)·它们的作用十分广泛,影响一大批操纵子,是基因转录的超级调控因子。 1.5 亮氨酸的影响
亮氨酸通过亮氨酸反应蛋白Lrp对基因表达的激活或阻遏起调节作用，某些亮氨酸影响基因表达的操纵子，外加丙氨酸也有类似效果。
2 原核生物基因的转录后调控
2.1 翻译起始的调控
遗传信息翻译成多肽链起始于mRNA上的核糖体结合位点（RBS）。所谓RBS是指起始密码子AUG上有的一段非翻译区。在RBS中有SD序列，富含G、A，该序列与核糖体16SrRNA的3’端互补配对，促使核糖体结合到mRNA上，有利于翻译的起始。此外，mRNA的二级结构也是翻译起始调控的重要因素。 2.2 稀有密码子的影响
由于细胞内对应于稀有密码子的tRNA较少，高频率使用这些密码子的基因翻译过程容易受阻，影响了蛋白质合成的总量。比如dnaG基因就是一个很好的例子。 2.3 重叠基因的影响
色氨酸操纵子由五个基因(trpE、D、C、B、A)组成，在正常的情况下,这五个基因产物是等量的。比较研究发现当trpE发生突变后,其临近的trpD的产量比下游的trpB、A要低，这是因为trpE基因的终止密码子和trpD的起始密码子之间共用了一个含碱基A核苷酸是重叠的，
这种重叠的密码是保证同一核糖体对两个连续基因进行翻译的机制·而在trpC和trpB之间相隔11个核苷酸,因而没有这种机制。这种偶联翻译机制可能是保证两个基因产物在数量上相等的重要手段。
2.4 ploy(A)对翻译的影响 mRNA 3’端ploy(A)的长短对翻译效率也有很大影响。细胞中蛋白质合成旺盛时，mRNA链上的核糖体数量就多，mRNA链上的ploy(A)也较长。 2.5 翻译的阻遏
序列分析表明，有些位点能形成稳定的茎-环结构，具备翻译阻遏特征。 2.6 魔斑核苷酸对翻译的影响
研究发现在缺少任何一种氨基酸的培养基中,不但蛋白质合成速率下降,而且RNA的合成也下降。后来又发现大肠杆菌突变株在色氨酸不足时,蛋白质合成停止,而RNA合成却没有下降。进一步研究发现前者能合成魔斑(ppGpp和pppGpp)，由于氨基酸缺乏,空载tRNA增多, 空载tRNA在核糖体上将正常合成蛋白质需要的GTP合成魔斑，PpGpp可以大范围内作出应急反应,以控制核糖体和其它大分子的合成,活化蛋白水解酶。 2.7 MicRNA对翻译的影响
真核生物基因表达的调控的特点 1 DNA染色质结构的调控
真核生物存在DNA和染色质的调控作用,原核生物无此特点，即以核小体为单位的核蛋白结构，只有当紧密压缩的异染色质转变为松疏、伸展形式的常染色质,在基因控制区改变结构,产生DNaseⅠ超敏感区,使基因激活,才能促进转录，组蛋白与DNA结合阻止DNA上基因的转录,去除组蛋基因又能够转录，DNA碱基修饰变化,甲基化可能阻碍转录因子与DNA特定部位的结合从而影响转录。 2 转录调控
2.1 顺式作用元件的调控
真核生物无操纵子以及与操纵基因相临的调节基因,但其转录受到与结构基因相距一定距离的特定顺式作用元件的影响如:增强子、启动子、位点控制区。真核生物的启动子,在-25~-35区含有TATA序列,在-70~-80区含有CCAAT序列,在-80~-110区含有GCCACACCC前者精确地保证转录起始;后两者控制转录起始的频率,不参与起始位点的确定，真核基因启动子区较大,转录成mRNA具有“帽子”结构，真核基因的增强子能使与它连锁的基因的转录频率明显增加，增强效应不受它在DNA上位置的影响,也不具有基因的专一性;但有严格的组织和细胞特异性,受外部信号的调控。
2.2 反式作用因子的调控
真核基因转录还需相应的反式作用因子作用,是通过顺式作用元件与反式作用因子复杂的相互作用实现的，反式作用因子主要是一些调控蛋白,不具有基因的特异性，另外,还有一些转录因子能与某个(类)蛋白质因子结合,控制基因特异性表达的上游序列,如:热激活应答元件HSE,糖皮质应答元件GRE,金属应答元件MRE等,这些应答元件与细胞内高度专一的转录因子相互作用,协调基因的相关转录。真核生物的DNA能根据发育阶段的需要,以基因丢失、拷贝数扩增、基因重排与移位等方式的进行发育调控,这种调控是可逆的,可从根本上改变某些细胞的基因组。
2.3 激素水平的调控
真核生物基因表达的激素调节相当于原核生物对环境变化所作出的反应。激素由细胞产生,再运送到靶细胞内实施调控。许多激素的调节作用是启始转录，激素调节具有很强的组织特异性。
3 RNA对基因表达的调控
tRNA,rRNA,mRNA为蛋白质翻译所必需，真核生物的前体tRNA先要经过核苷酸的修饰,生成4、5sRNA,再剪接为成熟的4sRNA、前体rRNA须经过核糖甲基化才能成熟;而原核生物的rRNA主要是碱基化。真核生物转录产生的mRNA,需进行一系列的加工,才能生成成熟的mRNA，包括mRNA5’端加“帽子”, 3’端加poly (A),以及内含子的精确剪接加工,原核生物却无此特点。此外, mRNA还会进行核苷酸的替换、插入、删除等编辑修饰,改变DNA模板的遗传信息。
4 翻译调控
4.1 翻译起始的调控
真核生物具有“帽子”结构,翻译效率受到“帽子”的制约，“帽子”结合蛋白CBP具有促进mRNA翻译蛋白的活性，但在高盐溶度下,有“帽子”的mRNA的翻译能力严重受阻。许多可溶性蛋白因子的修饰会影响翻译起始。 4.2 翻译延伸的调控
翻译起始后,核糖体并非一定能从起始密码顺序移至终止密码,mRNA编码区也会形成一些二级结构,使翻译速率下降,甚至中途停止。另外,3’端的poly(A)的长短、以及与rRNA的互补性也影响翻译水平。 4.3 蛋白质的加工成熟
翻译初生的原始蛋白质大多无生物活性,必须经过一系列加工才能成为有活性的蛋白质。这些加工包括切割多肽、多肽的有限水解、多肽的化学修饰(如:鳞酸化,糖基化)、多肽的剪接。 4、举出三种基因文库的构建中对重组质粒的筛选方法并解释其原理
重组DNA转化受体细胞后，须在不同水平上进行筛选，以区别转化子与非转化子、重组子与非重组子以及鉴定所需的特异性重组子。在转化过程中，并非每个受体细胞都被转化；即使获得转化细胞，也并非都含有目的基因，所以需采用有效方法进行筛选。筛选的方法包括：根据遗传表型筛选（包括抗生素平板筛选和α互补筛选等）、限制性内切酶分析筛选、核酸探针筛选、免疫学筛查法、菌落PCR筛选法、DNA-蛋白质相互作用筛选法、DNA序列分析等。
1、 抗生素平板筛选
其原理是：目标基因是Kan的抗性基因，而载体含Amp 的抗性基因，因此在含有Amp 和Kan的培养基中生长的菌落即为阳性菌落。大概步骤包括：首先制备含有Amp 和 Kan 的LB琼脂培养板 ； 然后将转化菌液涂布于含有Amp 和Kan培养板上，37℃培养；最后在含有Amp和Kan培养板上能生长的菌落即为阳性重组质粒，并将其接种于含Kan的LB液体培养基继续培养。小量制备质粒，限制性酶切分析进一步鉴定。