重组DNA分子的酶切、连接、转化和筛选
摘 要：本实验利用酶切后的目的片段（500bp）与puc18为材料，运
用氯化钙法制备感受态细胞和外源的重组体DNA转入受体菌细胞，经过筛选培养基筛选后得到重组子。
关键词：酶切 重组 筛选
前 言 重组克隆是指含有外源DNA的细胞增殖而产生的细胞群体，
或由其经生长、发育和再生而形成的组织、器官、个体。重组克隆的筛选主要依靠DNA载体上的选择标记，加上合适的选择（培养）条件来进行。一是通过选择培养基使只有带外源DNA的细胞才能生长；二是根据选择性遗传标记选择带有目的基因的细胞克隆。
1材料与方法
1.1材料
质粒DNA、目的DNA、E.coli受菌体、质粒pUC18、重组体DNA 1.2方法
1.2.1PCR法扩增目的片段（CER3A） 1.2.1.1 PCR反应体系 反应物 PCR Taq mix CER3Ar，CER3Af dd水 质粒CER3A
体积/ul 12.5 各1 9.5 1
1.2.1.2 PCR扩增条件 在PCR仪上设计94℃5min，然后进入循环，
循环中第一步为94℃30s，第二步为58℃退火30s，第三步为72℃延伸1min，共进行35次循环，然后再72℃延伸10min以提高产物的扩增率，取出放在4℃条件下终止反应。
1.2.2目的片段的电泳 将10倍loading buffer 5ul和25ulPCR产物混匀，在1.2%的琼脂糖凝胶中电泳，分析。
1.2.3目的片段的回收 通过琼脂糖电泳尽可能将目的DNA片段与其他片段分开，用干净的手术刀，将含目的片段DNA的琼脂糖凝胶块切下，放入2ml离心管称重。根据凝胶重量和浓度，按每100mg琼脂糖加400ml的比例加bufferB2。将离心管置于50℃水浴5~10min，间或混匀，直至胶块完全溶化。在酶切反应体系中加入5倍bufferB2，混匀。将熔化好的溶液全都移到吸附柱，静止2min，8000×g离心30s，倒掉收集管的液体，将吸附管放入同一收集管中。向吸附管中加入加入500ul Wash Solution，9000×g离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附管放在同一根收集管中。重复步骤（6）一次。将空吸附柱和收集管放入离心机，12000×g离心2min，打开瓶盖，放置2~5min，挥发酒精。换新的1.5ml离心管，在吸附膜中加入20ul dd水（pH≥8.0），温室静置5min，12000×g离心2min，将所得的DNA溶液置于-20℃保存或用于后续实验。 反应物 目的片段 SadⅠ
体积/ul 15 1.5
PstⅠ
10×loading buffer dd水
1.5 10 72
1.2.4目的片段和pUC18质粒的酶切 1.2.4.1目的片段的酶切 在37℃反应1~2h。 1.2.4.2 pUC18质粒的酶切 反应物 pUC18 SadⅠ PstⅠ
10×loading buffer dd水
体积/ul 15 1.5 1.5 10 72
在37℃反应1~2h。然后将吸取2ul酶切产物，加入10×loading buffer 1ul和dd水7ul，在1.2%琼脂糖凝胶上电泳，观察并分析结果。 1.2.5 DNA片段与质粒pUC18的连接（体积的量不确定） 反应物 目的片段 pUC18
6×loading buffer T4 ligase
体积/ul 5 5 1 2
1.2.6重组体DNA遗传转化与克隆筛选