微生物鉴定之生化实验大全

微生物鉴定之生化实验大全

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不同的细菌具有各自的独特的酶系统,因而对底物的分解能力各异,其代谢的产物也不相同。这些代谢产物又具有不同的生物化学特性,可利用生物化学的方法测定这些代谢产物以鉴定细菌。掌握各种生化反应的原理和应用是细菌鉴定的基础。生理生化特性的测定主要根据Shirling&Gottlieb《International Journal of Systematic Bacteriology》中鉴定的有关试验。

(一)碳水化合物代谢实验: 糖(醇、苷)类发酵实验

(1)原理:细菌分解糖的能力与该菌是否含有分解某种糖的酶密切相关,故分解糖的能力各不相同,细菌分解糖类后的终产物亦不一致,在含糖培养基中加入指示剂,若细菌分解糖则产酸或产酸产气,使培养基颜色改变,从而判断细菌是否分解某种糖或其他碳水化合物。

(2)基本培养基:在培养基中加入0.5%-1%的糖类(单糖、双糖、或者多糖)、醇类(甘露醇、肌醇)苷类(水杨苷、菊糖等)。培养基可为液体、半固体、固体或微量生化管几种类型。

(3)实验方法:取某一种细菌的24h纯培养物分别接种到葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖等培养基内,37℃培养24h,观察结果并记录。 (4)结果判定

如果接种进去的细菌可发酵某种糖或醇,则可产酸,使培养基由紫色变成黄色,如果不发酵,则仍保持紫色。如发酵的同时又产生气体,则在微量发酵管顶部积有气泡。 (5)应用:是鉴定细菌最主要最基本的实验,特别是对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。 氧化型与发酵型(O/F)的测定

(1)原理:细菌在分解葡萄糖的过程中,必需有氧的参加的,称为氧化型,细菌在分解葡萄糖的过程中,可以进行无氧降解的,称为发酵型。发酵型细菌无论在有氧或者无氧的环境中都能分解葡萄糖。不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。这在区别微球菌与葡萄球菌、肠杆菌科成员中尤其有意义。 (2)培养基:培养基蛋白胨2g,氯化钠5g,磷酸氢二钾0.3g,葡萄糖10g,琼脂3g,1%溴麝香草酚蓝3mL,蒸馏水1000mL。将蛋白胨、盐、琼脂和水混合,加热溶解,校正pH至7.2,然后加葡萄糖和指示剂,加热溶解;分装试管,3~4mL/管;115℃,高压蒸汽灭菌20min,取出后冷却成琼脂柱。

(3)实验方法:挑取18~24h的幼龄斜面培养物,穿刺接

种,每种细菌接种两管,于其中1管覆盖1mL灭菌的液体石蜡,37℃培养24小时或更长时间。 (4)结果判定。β一半乳糖苷(ONPG)实验

(1)原理:有的细菌可以产生β一半乳糖苷酶,能分解邻-硝基酚-β-D-半乳糖苷,而生成黄色的邻-硝基酚,在很低浓度下也可以检测出。

(2)培养基:邻硝基酚β-半乳糖苷0.6g,0.01mol/L pH7.5磷酸缓冲液1 000mL,pH 7.5的灭菌1%蛋白胨水300mL。先将前两种成分混合溶解,过滤除菌,在无菌条件下与1%蛋白胨水混合,分装试管,每管2~3mL,无菌检验后备用。 (3)实验方法:取一环细菌纯培养物接种在ONPG培养基上置37℃培养1~3h或24h,如有β-半乳糖苷酶,会在3h内产生黄色的邻硝基酚;如无此酶,则在24h内不变色。 七叶苷水解实验

(1)原理:有的细菌可以将七叶苷分解为七叶素和葡萄糖,七叶素与培养基中的枸橼酸铁的二价铁离子反应,生成黑色的化合物,使培养基呈黑色。

(2)应用:主要用于肠球菌与其它链球菌的鉴别,前者阳性,后者阴性,也可用于革兰氏阴性杆菌及厌氧菌的鉴别。 甲基红实验

(1)原理:细菌分解培养基中的葡萄糖产酸,当产酸量大,使培养基的pH降至4.5以下时,加入甲基红指示剂而变红,

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