实验九 人类染色体标本制备及核型分析
一、 目的
1． 了解人类外周血淋巴细胞染色体玻片标本制备方法。
2． 观察正常人体细胞染色体的形态、数目，掌握核型分析方法。
二、 试剂与器材
1． RPMI-1640培养基、小牛血清、PHA（5mg/ml）、秋水仙素（10μg/ml）、肝素（600 IU/ml）、固定液（甲醇：冰醋酸＝3：1）、低渗液（0.075mol/L氯化钾）、5%NaHCO3溶液、三蒸水、双抗(青、链霉素)、Giemsa染液（1%）、PH6.8磷酸缓冲液。
2． 超净工作台、恒温培养箱、恒温水浴箱、鼓风干燥机、离心机、冰箱、高压消毒锅、分析天平、注射器、培养瓶、离心管、滴管、滤器、滤膜、酒精灯、载玻片。
3． 显微镜、人类染色体玻片标本、拭镜纸、二甲苯、香柏油、人类染色体放大照片、核型纸、剪刀。
三、 内容
1． 观看电教：人体外周血培养及染色体标本的制备。 2． 人体外周血淋巴细胞的培养及染色体玻片标本制作。 3． 正常人体细胞染色体核型分析。
人类染色标本的制作
(一) 实验原理
人体外周血淋巴细胞是保持了增殖潜能的暂不增殖细胞（G0细胞），一般可在血液中循环几年都不分裂。但在人工离体培养条件下，若在培养基中加入PHA（phytohemagglutinin，植物血细胞凝集素），PHA可刺激G0细胞转化为淋巴母细胞，重新获得增殖能力，并进行有丝分裂。然后在培养基中加入适量秋水仙素（colchicne），使分裂细胞停滞于中期。用低渗溶液处理，使分裂细胞膨胀。细胞悬液滴片后，通过加热使已膨胀的细胞爆裂，将染色体分散开来。最后用Giemsa染色，即可获得中期染色体标本。 (二) 操作步骤
1． 培养液配制 RPMI-1640粉剂10.4g，碳酸氢钠2.0g，溶于1000ml三蒸水中，过滤除菌。
2． 在无菌条件下，用量筒取
RPMI-1640 80ml 灭活胎牛血清 20ml 青霉素 100U/ml 链霉素 100U/ml
将上述溶液混匀，用5%灭菌碳酸氢钠或1mol/L HCl，调整培养液PH至7.2-7.4，分装培养瓶，每瓶5ml，使用前，每瓶临时加1%PHA0.5-2ml，用注射器5号针头滴入500μg/ml肝素，摇匀。 3. 培养
(1) 采血和培养 用灭菌注射器抽取600μg/ml的肝素0.2ml，润湿针筒，然后将多余的肝素弃去。常规消毒被检者的肘部皮肤，从肘部静脉采血1ml，分装于培养液的培养瓶中，每瓶装入全血10滴(7号针头)，摇匀，静置于37℃恒温培养箱中，培养68 -72小时。
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(2) 秋水仙素处理 终止培养前4小时-6小时，加入10μg/ml秋水仙素0.2ml，使最终浓度为0.4μg/ml。轻轻摇匀，放回培养箱中，继续培养4 -6小时。 4．
(1) 收集细胞：用吸管将培养物混匀，并移至10ml刻度离心管内，以1000r/min离心8分钟。
(2) 低渗处理：吸去上清液，加入预热至37℃的0.075mol/LKCL,用吸管混匀，放回37℃水浴箱中，静置15分钟。 5.
(1) 预固定：低渗15分钟后，加入新配制的固定液(甲醇：冰醋酸=3：1)1ml，混匀。静置15分钟后，以1000r/min离心8分钟。
(2) 固定：除去上清液，加入固定液8ml，混匀，静置30分钟，以1000r/min离心8分钟。(3) 再固定：除去上清液，加入固定液8ml，混匀，静置30分钟，以1000r/min离心8分钟，除去上清液。视细胞数量的多少，加入少许固定液，制成细胞悬液。 6.
(1) 滴片：用吸管吸取上述细胞悬液3-4滴，滴于在冰水中浸泡后的清洁载片上，随即呼气吹片，使细胞散开，自然干燥。
(2) 染色：用1∶10的Giemsa染色20-30分钟，自来水冲洗，干后镜检，封片。 (三) 注意事项
1． 凡是细胞培养过程中所涉及的一切溶液试剂和玻璃器材必须保证严格无菌。
2． 用于制备培养基的水达不到质量要求是细胞培养失败的主要原因之一，因而要使用三蒸水。
3． PHA效价不好是细胞分裂相少的原因之一，因此，培养基中PHA的使用量要在试用后确定。
4． 在细胞培养过程中，每天至少要摇瓶一次，以利于细胞良好生长。
5． 如果染色体分散不好，可先将载玻片用45%的冰醋酸液浸湿，然后立即将细胞悬液滴在载玻片上，并立即在酒精灯火焰上来回通过3～5次，这可在很大程度上改善染色体的分散状况。
正常人体细胞的核型分析
(一)
取上述制好的正常人体细胞染色体玻片标本，先在低倍镜下观察，选择染色体分散良好，无重叠的分裂中期细胞，转至油镜下仔细观察分析。首先数该细胞染色体总数(图9-1，2)，再注意观察染色体形态，每条染色体含两条姐妹染色单体，并相连于一着丝粒，注意每条染色体的大小和着丝粒的位置。区分中央着丝粒染色体，亚中着丝粒染色体和近端着丝粒染色
根据国际会议提出的标准，即按照染色体长度和着丝粒位置以及其它特征，将人类体细胞染色体分为七组，如下表。 组号 染色体号 形态大小 A
1-3
最大
着丝粒位置 1、3号为中央着丝粒；2号亚中着
丝粒 亚中着丝粒 亚中着丝粒
随体 次级缢痕 无
1
鉴别特点
B C 4-5 6-12+X 次大 中等 无 无 9
X染色体在6-7或7-8
号之间
2
D E 13-15 16-18 中等 小
F G 19-20 21-22+Y 次小 最小
近端着丝粒 16号为中央着丝粒；17、18号为亚中着丝粒 中央着丝粒 近端着丝粒
有 无 16
无 有 Y染色体
长臂常平行
根据上述特征，将染色体分组列号(先找A、B组，再找D、G组，然后找E、F组，最后剩下的为C组)
在玻片标本上观察2-3个中期分裂相，数出每个细胞的染色体总数（最好根据细胞中染色体自然分布的区域进行分区计数，然后再求总和，否则容易造成计数的重复或遗漏），并辨别是男性细胞还是女性细胞，写出其核型。 （二)
将实验指导上的人类染色体照片纸剪下。依据照片上每条染色体的轮廓将各染色体剪下，按染色体大小及着丝粒位置，排成一行。仔细辨别，首先按各组染色体的特征，确定每个染色体所属组别，再在各组内分辨染色体序号。将剪下的染色体一一配对，贴于核型纸上(注意着丝粒位置应贴在序号的横线上，短臂向上，长臂向下，不要倒贴)
图9-1 正常男性核型：46，XY 图9-2 正常女性核型：46，XX
(三)
剪贴染色体核型图，做出核型分析报告。
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