关于鉴定抗根结线虫研究方法的综述
摘要：根结线虫是世界上对植物破坏最大的病原体之一，鉴定和筛选抗根结线虫的植株具有重要意义。本文概述接种源的获取方法及其对接种线虫的影响和鉴定方式，鉴定方式包括一般接种、高持续接种和组织培养基内接种。
关键词：根结线虫;接种;组织培养
Review on the way of selecting plants to resisting root-knot
nematodes
Qiao Feng, Wang Jingmin, Li Jinghua
Abstract: Root-knot nematodes (RKN) were one of the pathogens damaged to plants mostly in the world. It was important to select the plants resisting RKN. The article mainly talked about the ways of getting RKN and how to the ways effected the inoculation, how to selecting the resistance plants, including the general inoculation, the high and durable inoculation, the inoculation in the plant medium.
Keywords: root-knot nematodes; inoculation; tissue culture
根结线虫（Meloidogyne spp.）能够侵染热带和温带植物的根系，是世界上对植物破坏最大的病原体之一[1]。目前，药剂防治效果都不是很理想，而且一些高毒有效的杀线剂已被禁止使用。生产中可以通过栽培持续高抗的品种，以达到防治RKN的目的。因此，需要一种简便、快速的抗性品种的鉴定筛选方法，尤其是木本植物。本文介绍接种源的获取方式及其对抗性筛选的影响和最常用的鉴定方式，如一般接种、高持续接种、扦插和组培获得幼苗后接种、组织培养基内接种，以及适用于木本植物的发根农杆菌介导的组织培养接种，并指出抗线虫植株鉴定筛选的趋势是向快速、简便的分子标记方向发展。 1 接种源的获取方法及其对接种RKN的影响
一般RKN的接种源分为卵块、卵、二龄幼虫（Second-stage juveniles，J2)，由于卵块的收集需要一定长的时间，而且每个卵块中卵的数量不一致，不能够形成一定的接种标准，其次，接种时，由于是卵块，不能够较均匀的分散在植物根系的周围，最后，其他病原体和根腐病菌可通过卵块侵染植物，引起病害。J2从获得到接种的时间必须要短，以防止J2死亡，侵染能力下降，另外还要保证J2比较适宜的生活条件，防止J2死亡或侵染率下降。相对而言，卵的获得较方便快速，可以通过NaClO溶液冲洗的方法[2]获得，同时，卵的表面被消毒，不会携带任何病原体，接种时，可以制定一定浓度的悬浮液，做到接种量上的统一，并且可以均匀的侵染植物根系。
接种源不同的获取方法对RKN的侵染都有一定的影响。根据Hussey 1973的报道，用离心[3]或机械粉碎获得卵的方法对其孵化和侵染都有一定的破坏作用，如卵的孵化率降低和卵的数量减少，在潮湿环境中，孵化的RKN侵染率更低。用1.05% NaClO溶液冲洗[2]获得卵的方法对其孵化和侵染影响都比较小，表明用1.05% NaClO溶液冲洗收集到的卵作为接种源最为合适。
2 鉴定方式的研究 2.1 一般的接种方法
在鉴定筛选抗性植株中，常用含有一定数量的J2悬浮液进行接种[3]。通过控制每株植株所用J2悬浮液体积控制RKN的接种量。具体操作为用移液枪在距离植物茎1cm左右处，注射到2cm深的小洞中，到7d后或30d左右观察植株根系的变化，即根结的数量、根结指数，或到30d左右测定每克根中卵、J2或雌虫数量（线虫的数量可以通过酸性品红染色的方法进行计数），从而确定植株的抗性级别。木本植物中，常用根结指数的分级标准
[4]
:0=0%;1=1%-10%；2=11%-30%；3=31%-70%；4=71%-90%；5＞90% 。该方法简便、快
速，接种量虽然是标准统一，但是在筛选抗性植株中不容易区分高抗的植株。 2.2 高持续接种
该接种方法能够弥补一般接种方法无法明显区分高抗植株的缺陷，可以连续大量的对筛选植株进行接种，获得的抗性植株较准确。具体操作[5]：在接种前，培育大量感病的番茄苗，当番茄长到5叶龄时，接500 J2；两个月后，一部分去掉接种番茄的上部，把它的根和土壤整体移到需要鉴定植株的营养钵内，一段时间后，测定根结数等指标；另一部分，也去掉上部，从开始到测定抗性指标期间，每隔一段时间测定土壤中和番茄根内的线虫和卵的数量，从而确定各个时期的接种量。 3.3 离体抗性鉴定及其改进 3.3.1离体抗性鉴定
由于木本植物的生根时间较长，如果用常规的繁殖方式，如绿枝扦插、硬枝扦插，一年中只能做2-3次，这些都严重影响了植物的抗性鉴定。组培育苗能够实现周年育苗，从而为抗RKN的鉴定提供充足植株。组培育苗后可以通过炼苗移栽后进行抗性鉴定，或者直接在培养基内接种RKN进行鉴定。
组培育苗鉴定RKN抗性时，最主要的是看外源生长素是否对组织培养获得的植株产生抗性修饰，导致其抗性消失。有的文章已经报道桃树在组培过程中受外源萘甲酸的影响，抗性降低[6]。但是，Esmenjaud等人[4]证明通过组织培养获得紫叶李对RKN的抗性不会受到外源激素的影响。因此，在利用组织培养扩繁抗性植株时，需要鉴定生长素及其不同浓度对扩繁植株抗性的影响，最后才能对其进行抗性鉴定。结合组织培养的方式进行对RKN的抗性鉴定，能够缩短鉴定时间，而且在一年内可进行多次育苗，实现多次鉴定。 3.3.2 培养基内抗性鉴定
由于在土壤中很难观察植株对RKN抗性的程度，而且不能够直接观察RKN的侵染过程。因此，Sijmons等人[7]在1991年提出在培养基中鉴定植株对RKN的抗性以及观察RKN的侵染过程。通过筛选感RKN的拟南芥和适宜RKN侵染的培养基，确定促进生根的Knop(1860)培养基对RKN的侵染不会产生影响，并且观察到蔗糖的浓度及质量和培养基的硬度都会影响到RKN的侵染效率。利用拟南芥根较细并且透明的特点，在培养基中能够观
察到RKN的侵染和生长发育过程。该方法实现了在培养基内鉴定植株对RKN的抗性和观察RKN在植株根系中的生长发育，使抗RKN的鉴定完全在室内进行，并且更容易观察其发病情况。
图1 发根农杆菌侵染后咖啡树生根情况
（a）:发根农杆菌侵染4周后；(b)侵染5周后；（c）侵染12周后；（d）发根农杆菌侵染2个月后的植株。
由于木本植物发根较慢，2006年，Alpizar等人[8]利用发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）能够引起侵染植物生出大量毛状根的特性，向咖啡树中转入发根农杆菌，促使植株快速长出大量毛状根（如图1），以便进行抗性鉴定。通过对比实验，证明发根农杆菌不会改变植株对RKN的抗性，但是，抗RKN的鉴定是在移出培养基后鉴定的，并不是在组织培养基内鉴定。在2011年，Esmengaud等人[9]鉴定紫叶李对RKN抗性的时候，使用发根农杆菌侵染紫叶李促使其发根并在培养基中接种RKN,进行抗性鉴定（如图2），
图2 根结线虫侵染培养基内紫叶李的根系
（a）线虫侵染16天后，根结的表型；（b）根尖巨型细胞；（c）根结荧光显色。
4 讨论与展望
抗RKN植株的筛选过程是一个复杂的过程，筛选植株的方法已经从田间鉴定发展到实验室内鉴定，因此，也需要一定的抗性评定标准。抗性的评定指标很多，如根结指数、每克根中雌虫线虫数、J2数、卵数和总的线虫数量等等，这些都是生物学上的分析评定，对极抗病植株和极感病植株的判断较准确，但是中间类型的判断就比较模糊。考虑到从育苗到接种，再到抗性评价整个过程的繁琐性，需要从分子层面进行抗性鉴定，相信随着分子技术的不断发展与成熟，以及抗性基因的发现，从分子方面快速鉴定抗性是一种发展趋势。 参考文献：
[1] Trudgill DL, Blok VC. Apomictic, polyphagous root-knot nematodes: exceptionally successful and damaging biotrophic root pathogens. Annu Rev Phytopathol 2001;39:53–77.
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[4] Esmenjaud, D., R. Voisin, J.C. Minot, G. Salesses, R. Poupet, and J.P.Onesto. 1993. Assessment of a method using plantlets grown from in vitro for studying resistance of Prunus cerasifera Ehr. (Myrobalan plum) to Meloidogyne spp. Nematropica 23:4148.
[5] Esmenjaud, D., C. Scotto La Massèse, G. Salesses, J.C. Minot, and R.Voisin. 1992.Method and criteria to evaluate resistance to Meloidogyne arenaria in Prunus cerasifera Ehr. Fundamental Applied Nematol.15:385–389.
[6] Kochba J, Samish R M. Effect of kinetin and 1-naphthylacetic acid on root-knot nematodes in resistant and susceptible peach rootstocks[J]. Amer Soc Hort Sci J, 1971.
[7] PC Sijmons, FMW Grundler, N Mende…Arabidopsis thaliana as a new model host for plant‐parasitic nematodes 1991. The Plant journal,1(2),245-254
[8] E. Alpizar · E. Dechamp · S. Espeout · M. Royer ·A. C. Lecouls · M. Nicole · B. Bertrand ·P. Lashermes · H. Etienne 2006. Ef?cient production of Agrobacterium rhizogenes-transformed roots and composite plants for studying gene expression in coffee roots. Plant Cell Rep (2006) 25: 959–967.
[9] Bosselut N, Van Ghelder C, Claverie M, Voisin R, Onesto JP, Rosso MN,Esmenjaud D (2011) Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of Prunus as an alternative for gene functional analysis in hairy-roots and composite plants. Plant Cell Rep (in press)