模块七 蛋白质之间的相互作用 1. 实验目的
本实验以重组质粒和酵母细胞为材料, 学习检测蛋白质相互作用的基本原理和技术方法。 主要介 绍酵母双杂交的基本原理与操作技术; 让学生了解和掌握酵母双杂交系统的应用; 掌握酵母感受态的 制备的基本原理和主要的操作步骤。
2. 实验原理
1989年 Fields 和 Song 等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认识(即细胞内基因转 录的起始需要转录激活因子的参与 ,提出并建立了酵母双杂交系统。该系统作为发现和研究活细胞 体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台,近几年得到了广泛的运用和发展。
相比于其它蛋白质筛选系统,酵母双杂交系统具有以下优点:(1检测在真核活细胞内进行,在 一定程度上代表细胞内的真实情况。 (2作用信号是在融合基因表达后,在细胞内重建转录因子的作 用而给出的,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。 (3检测结果是基因表达产物的积累效应,因而可检测 存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互作用。 (4酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型 和分化时期材料构建 cDNA 文库,能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功 能蛋白。 (5 通过 mRNA 产生多种稳定的酶使信号放大。同时,酵母表型、 X-Gal 及 HIS3 蛋白表 达等检测方法均很敏感。
酵母双杂交系统也具有一定的局限性。 首先, 经典的双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细 胞核内, 因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白的研究。 酵母双杂交系统的另一个局 限性是“假阳性” 。在酵母双杂交系统建立的初期阶段,由于仅仅采用 β-半乳糖苷酶这一单一的报告 基因体系,这种报告基因的表达往往不能十分严谨地被控制,因此容易产生假阳性。由于某些蛋白本 身具有激活转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用, 使 DNA 结合结构域融合蛋白在无特异 激活结构域的情况下也可被激活转录。 另外某些蛋白表面含有对多种蛋白
质的低亲和力区域, 能与其 他蛋白形成稳定的复合物,从而引起报告基因的表达,产生“假阳性”结果。产生“假阴性”结果的 原因可能有许多蛋白质间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、 磷酸化和二硫键形成, 还有些蛋白 的正确折叠和功能有赖于某些非酵母蛋白的辅助等。
现在的酵母双杂交系统大都采用多种报告基因,如 AH109酵母株含有三类报告基因— ADE2、 HIS3、 MEL1/lacZ,这三类报告基因受控于三种完全不同、异源性的 GAL4-反应元件和三类启动子元 件 -GAL1、 GAL2以及 MEL1(如图 6-1-1 。通过这种方法就消除了两类最主要的假阳性,一类是融 合蛋白可以直接与 GAL4结合位点结合或者是在结合位点附近结合所带来的假阳性; 另一类是融合蛋 白和某种转录因子结合后再结合到特定的 TA TA 盒上所带来的假阳性。 ADE2一种报告基因就已经能 够提供较强的营养选择压力,这时选择性地使用 HIS3报告基因,一来可以降低假阳性率;二来可以 控制筛选的严格性(如果需要筛选与诱饵蛋白具有较强结合的蛋白,就可以同时使用 ADE2、 HIS3两 种报告基因; 如果只需要筛选与诱饵蛋白具有中等强度或较弱结合的蛋白, 就可以使用 ADE2或 HIS3两者中的一种 。 MEL1和 lacZ 分别编码 α-半乳糖苷酶和 β-半乳糖苷酶,可以作用于相应的底物
X-α-Gal 和 X-β-Gal 使酵母变蓝。其中, α-半乳糖苷酶是外分泌酶,在酵母表面就能直接检测到; β-半乳糖苷酶是内分泌酶, 需要将酵母破碎后才能检测到。 用蓝斑显示酵母细胞内两个蛋白的相互作用 的方法不仅具有较高的敏感性,而且蓝斑的深浅还可以反映两个蛋白相互作用的强弱。
随着酵母双杂交系统的广泛应用, 这一系统得到了不断的完善及改进, 除了经典的双杂交系统以 外,同时也衍生出单杂交系统、三杂交系统、反向酵母双杂交系统、 hSos/Ras募集系统(hSos/Ras recruitment systems 、泛素分裂系统(Split-ubiquitin systems 、双诱饵系统(Dual-bait systems等一 系列相关系统,根据这些系统的不同特点,可以分别应用于蛋白质与 DNA 、 RNA 的相互作用、蛋白 质复合体之间的相互作用、 膜蛋白质之间的相互作用、 筛选阻断蛋白间相互作用的药物等一系列领域, 对经典的酵母双杂交系统起到了很好的补充,并有力地推动了酵母双杂交系统的发展与应用。
酵母双杂交系统的原理是利用转录激活因子在结构上是组件式的, 即这些因子往往由两个或两个 以上相互独立的结构域构成,其中有 DNA 结合结构域(DNA binding domain, DB 和转录激活结构 域(activation domain, AD ,它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的 DB 虽然能和启动子结 合,但是不能激活转录。而不同转录激活因子的 DB 和 AD 形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录 的功能。根据转录因子的这一特性,将 BD 与已知的诱饵蛋白质 X 融合,构建出 BD-X 质粒载体; 将 AD 基因与 cDNA 文库,基因片段或基因突变体(以 Y 表 融合,构建 AD-Y 质粒载体。两个 穿梭质粒载体共转化至酵母体内表达。 蛋白质 X 和 Y 的相互作用导致了 BD 与 AD 在空间上的接近, 从而激活 UAS 下游启动子调节的酵母菌株特定报告基因(如 LacZ , HIS 3, LEU 2等 的表达(图 6-1-2 ,使转化体由于 HIS3或 LEU2表达,而可在特定的缺陷培养基上生长,同时因 LacZ 表达而 在 X-α-Gal 存在下显蓝色。
酵母双杂交原理示意图 3. 实验仪器
微量取液器(2 μL; 20 μL; 200 μL; 1,000 μL 、低温离心机、台式离心机、琼脂糖凝胶电泳系 统、蛋白凝胶电泳系统、凝胶成像系统、半干转移系统、恒温摇床、恒温孵箱、通风橱、制冰机、振 荡器、恒温金属浴、无菌接种环、 10 cm培养皿、 15 cm培养皿。
4. 实验试剂
(1裂解缓冲液(Cracking buffer : 尿素 8 mol/L SDS 5 %