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文件编码： QC-SOP(B)002-01 试验菌复活、传代和保存标准操作规程 审核人： 审核日期： 执行日期： 批准人： 批准日期： 共4页 第1页 起草人： 起草日期： 颁发部门：质量管理部 变更原因： 变更内容： 分发部门：人事行政部、质量管理部 目 的：规范试验菌的复活、传代和保存操作，保证试验菌种的质量。 范 围：适用于本公司试验菌的复活、传代和保存操作。 责任人：QC。
依 据：《中华人民共和国药典》2015年版。 内 容：
1.实验准备
灭菌移液管、灭菌平皿、废物收集桶、接种环、酒精灯、镊子、75%乙醇消毒液、75%酒精胶花、胰酪大豆胨液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、PH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、沙氏葡萄糖琼脂培养基、0. 05% (m l/m l)聚山梨酯8 0的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、砂轮
2.菌种的复活
2.1把冻干菌种管、灭菌1ml移液管、灭菌平皿、镊子、灭菌培养基、灭菌琼脂斜面数支、相应的无菌稀释液和废物收集桶，通过传递窗移入阳性间净化工作台。
2.2先用砂轮将冻干菌种安瓶颈部挫出刻痕,再将冻干菌种管外壁用75%乙醇擦洗消毒、稍干,用75% 乙醇胶擦净,放在灭菌平皿内,待干.点燃酒精灯,将菌种管的封口一端在火焰上,烧灼红热,用灭菌滴管吸取0.9%无菌氯化钠
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文件编码： QC—SOP(B)002—01 试验菌复活、传代和保存标准操作规程 共4页 第2页 溶液,滴在灼热的菌种管封口一端,使骤冷而炸裂。
2.3取灭菌镊子,在火焰旁,将炸裂的管口打开,放入灭菌平皿内,另取1支灭菌移液管,在火焰旁吸取灭菌液体培养基少许,加至菌种管底部,将冻干菌搅动促使溶解,随即将管内菌液分别接种至适宜的灭菌琼脂斜面及液体培养基内,并将滴管及菌种管投入消毒液内,将已接种的琼脂斜面及液体培养基于适宜的条件下进行培养。
2.4根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度（细菌培养温度30～35℃，培养18～24小时；真菌培养温度20～25℃，培养3～5天。观察是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌处理。 2.5黑曲霉的菌悬液先室温待菌悬液融化后用无菌吸管吸取管内液体1～2滴滴在沙氏葡萄糖琼脂斜面上，用吸管涂布均匀，置20～25℃培养5～7天，斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色，斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。确认后用含有0.05%（ml/ml）的吐温-80的0.9%无菌氯化钠溶液洗脱到无菌试管中。
2.6黑曲霉的（2.5）项下洗脱液按（2.5）项下方法涂布于沙氏葡萄糖琼脂斜面上进行复壮。
3.菌种斜面传代操作
培养基应新鲜制备,如斜面已无冷凝水者,不宜再使用.标签上注明菌种名及菌种编号.至冰箱取出的菌种斜面,应在室温放置约30分钟,待温度平衡
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文件编码： QC—SOP(B)002—01 试验菌复活、传代和保存标准操作规程 共4页 第3页 后再移入阳性工作室。
点燃酒精灯,用左手握住菌种斜面,将管口靠进火焰旁,右手拿接种棒后端,将接种环烧红30秒,随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼,往返通过3次.左手将管口在火焰上旋转烧灼,右手用无名指、小指及掌部夹住胶塞,拨开胶塞,将接种环伸人管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下,稍冷却再移至菌苔上,刮取少量菌苔,随即取出接种棒,并将菌种管口移至火焰旁。
堵上胶塞,左手将菌种管放下,取灭菌琼脂斜面1支,照上述操作打开胶塞,将接种环伸入管内至琼脂斜面的低部,由底向上,将接种环轻贴斜面的表面曲折移动,使细菌划在斜面的表面上。
取出接种环,在火焰旁将培养基管胶塞堵上,然后将接种过细菌的接种棒在火焰上烧灼灭菌。
4.菌种的培养与保存
培养条件：大肠埃细菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌于胰酪大豆胨液体培养基中30~35℃培养不超过3天；白色念珠菌、黑曲霉涂布于沙氏葡萄糖琼脂培养基斜面，白色念珠20~25℃培养不超过5天、黑曲霉20~25℃培养不超过7天。
菌种传代后将培养管自培养箱取出后放人冰箱（2-8℃）保存, 1个月转种一次。
5.菌种的使用及销毁
每次进行菌种复活时，只能复活一个菌种。如果要复活其他菌时，应
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