TGEV单克隆抗体的制备及检测方法的建立
猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis of pigs,TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible Gastroenteritis virus of swine,TGEV）引起的一种高度接触性的消化道传染性疾病,多发于冬春季,主要临床症状为腹泻和呕吐,仔猪感染后死亡率达到70%以上,造成了严重的经济损失。因此,在感染初期对TGE快速准确的诊断,是至关重要的。
通过对TGE抗原和抗体检测方法的研究,可以更好的防控疫情。本实验通过超速离心和蔗糖密度梯度离心对TGEV进行纯化,免疫BALB/c小鼠,三次免疫后细胞融合,通过间接ELISA法筛选阳性的杂交瘤细胞,并用有限稀释法对阳性细胞进行克隆,4次亚克隆后获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,分别为3G11、1D6、2E5和5D1。
通过Western blot发现4株单抗均是特异性针对TGEV-N蛋白;4株细胞中,3G11、2E5和5D1的亚类均为IgG1,1D6的亚类为IgM;间接免疫荧光实验鉴定4株单抗均能与感染TGEV的细胞结合;特异性反应实验中,4株单抗与猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪轮状病毒（PRV）和II型猪圆环病毒（PCV2）均不反应。用BALB/c小鼠制备3G11单抗细胞的腹水,通过纯化柱对腹水进行纯化,测定效价为105。
用实验室保存的TGEV-N蛋白单抗E10F10D5和本研究制备的3G11单抗建立了双抗体夹心ELISA检测方法。与传统的双抗体夹心ELISA相比,本实验将检测抗体3G11与HRP进行偶联,省去了酶标二抗的孵育,减少了操作步骤和时间。
通过对反应条件的摸索和优化,确定了当E10F10D5单抗包被浓度为4μg/mL,HRP-3G11单抗工作浓度为1∶800稀释时,检测效果最佳。而且处理粪便样
品时,不需要加入病毒裂解液,只需混匀冻融即可。
通过进一步的分析,证实该方法有良好的特异性、敏感性和重复性,临床样品检测的符合率达到92.6%,可以用于临床检测。本实验还用HRP标记的3G11单抗建立了检测组织中病毒的免疫酶组织化学法。
为了确定HRP标记的3G11单抗是否可用于检测组织病料中感染的TGEV,首先通过细胞培养的TGEV检测病毒与HRP-3G11的反应情况,结果可见HRP-3G11单抗可以特异性与TGEV结合。通过对一周龄仔猪攻毒感染TGEV,分别取十二指肠、空肠和回肠,用HRP标记的3G11抗体作为一抗,建立了检测病料组织中TGEV的免疫酶组织化学法。
与未标记抗体的检测结果比较没有明显差异,表明HRP标记的3G11单抗可以用于小肠组织中TGEV的检测。为建立检测TGEV抗体的间接ELISA方法,对实验室保存的表达TGEV-N蛋白的菌种pProExHTb-TGEV-N/BL21进行活化,诱导表达并纯化了TGEV-N蛋白,用纯化的蛋白作为包被抗原,建立了检测血清抗体的间接ELISA方法。
优化后的反应条件为包被抗原浓度0.5μg/mL,最佳封闭时间为37℃1 h,血清样品最佳检测的稀释度为1∶160,作用时间为37℃1 h,二抗HRP标记的兔抗猪IgG最佳作用时间为37℃45 min。该方法可以特异性的检测TGEV阳性血清,有良好的敏感性和重复性,可用于临床上TGEV抗体的检测。
综上,本实验利用HRP标记的3G11单克隆抗体,建立了检测TGEV粪便病料的双抗体夹心ELISA方法和检测组织病料的免疫酶组织化学方法;利用纯化的TGEV-N蛋白,建立了检测TGEV抗体的间接ELISA方法。这三种检测方法的建立为临床上TGE的有效防控奠定了基础。