M13噬菌体

M13噬菌体

M13 phage

一种丝状噬菌体，可感染含F因子的大肠杆菌细胞。 遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科）

M13噬菌体是一种丝状噬菌体，内有一个环状单链DNA分子，长6407

个核苷酸，含DNA复制和噬菌体增殖所需的遗传信息。M13DNA的复制起始位点定位在基因间隔区内。但是基因间隔区的有些核苷酸序列即使发生突

变、缺失活插入外源DNA片段，也不会影响M13DNA的复制，这为M13DNA构建克隆载体提供了条件。

其中M13mp系列对野生型M13加以改造，插入了多克隆位点和 LacZ基因，可容纳外源DNA300-400bp，可用于制备DNA测序时用的单链模板和核酸探针。

它是一种质粒载体。

M13噬菌体在感染雄性大肠杆菌（F+或Hfr）时，都是以一端吸附在F型菌毛的顶端，所以称为F特异性丝状噬菌体。而对雌性大肠杆菌（F-）不敏感。所以Hfr型的大肠杆菌和携带F'质粒的大肠杆菌都能被感染

相关应用配置：M13噬菌体单链基因组DNA快速提取试剂盒

相关例子：兔抗M13噬菌体酶标抗体的制备，M13噬菌体已被广泛地应用于噬菌体展示技术。M13的酶标抗体,是在噬菌体展示技术筛选结果ELISA检测中不可缺少的试剂。我们制备了兔抗M13抗血清,其效价高于1:6000;经两步饱和硫酸铵沉淀,初步纯化了兔抗M13抗体;用过碘酸钠法对抗体进行了辣根过氧化酶的标记,酶标记抗体活性为1:6400。

噬菌体释放方式： M13噬菌体溶源性，不裂解宿主菌。极大地简化了每轮淘选过程中的噬菌体纯化

步骤，只用简单的PEG沉淀方法即可。

融合方式：M13噬菌体N端与pIII蛋白融合，不适合克隆cDNA，因为cDNA中为oligo d(T))常位于翻译终止密码子的下游。

融合序列大小：M13噬菌体展示肽库为7肽、12肽和环7肽

NEBM13噬菌体展示肽库可用于定位抗原决定簇， 确定蛋白质相互作用位点， 鉴定酶的底物或抑制物， 鉴定受体激活物或抑制剂， 研制多肽药物，开发新药， 肿瘤治疗和 疫苗制造，用途广泛

M13噬菌体感染雄性大肠杆菌需要完整的F菌毛，通过F因子编码的性菌毛进入宿主细胞内，如果噬菌体DNA通过感染导入细菌，那么也可以感染雌性大肠杆菌，但是通过转染产生的子代颗粒不能感染培养基中的其他细菌，所以病毒的产量很少

单链和双链M13噬菌体DNA的大规模制备：这个方案主要用于制备大量M13噬菌体的双

链DNA，因在实验室中M13噬菌体经常被用作克隆载体，以及在某些特殊用途时需要制备大量的单链噬

菌体DNA，如当一个特定的重组体被多次用于制备反射性标记探针或构建大量定点突变体时。也许最重要的是，大规模制备和单链DNA可以分为小份，被实验室中所有人用作双脱氧测序反应和转染的标准对照。 方法:

M13噬菌体RF DNA制备:

1、将2.5ml铺板菌液转移至无菌试管（13*100mm或17*100mm）。加0.5mlM13噬菌体原液（约5*1011pfu），轻拍试管壁混合，室温放置5min。

2、将感染细胞用装在2L摇瓶中的250ml预热至37℃的含5mmol/L MgCl2的LB或YT培养基稀释。37℃持续振荡培养5h。

3、4℃ 4000g（Sorvall GSA 转头为5000r/min）离心15min收集感染细胞。回收上清可用于按以下步骤7-17的方法大规模制备M13噬菌体的单链DNA.

4、细菌沉淀用100ml冰冷的STE重悬，4℃ 4000g（Sorvall GSA 转头为5000r/min）离心15min回收洗后的细胞。

5、用碱裂解法分离噬菌体闭合环状 RF DNA。适当增大裂解液的体积。纯化DNA可用PEG沉淀或层析柱纯化或CsCl梯度离心。

6、用分光光度法测定DNA浓度，并用凝胶电泳法确定其完整性。将闭合环状DNA分成小份-20℃冻存。 M13噬菌体单链DNA制备:

7、从感染细胞培养液中的噬菌体颗粒中分离单链DNA，将步骤3的上前转移至一家有磁搅拌子的500ml烧杯。

8、上清中加入10gPEG和7.5gNaCl，室温搅拌30-60min。

9、4℃ 10000g（Sorvall GSA 转头为7800r/min）离心20min收集沉淀。倒置离心瓶2-3min，使上清流净，用Kimwipes纸巾吸去瓶壁和颈上残留的上清。

10、瓶中加入10ml 10mmol/L的Tris-HCl(PH8.0),搅动瓶中溶液，并用巴斯德吸干充分冲洗瓶壁，当噬菌体沉淀溶解后，将溶液移至30mlCorex离心管中。

11、在噬菌体悬液中加入等体积的酚，用硅橡胶塞塞紧后剧烈振荡2min，混匀内容物。

12、室温以3000g（Sorvall GSA 转头为5000r/min）离心5min，上层水相转移至一个心管，再用10ml 酚：氯仿抽提。

13、用等量的水相转移至两个30mlCorex离心管中，各加入3mol/L乙酸钠（ph5.2）0.5ml和乙醇11ml。充分混合后室温放置15min。

14、4℃ 12000g（Sorvall SS-34 转头为10000r/min）离心20min回收单链DNA陈丹，小心移去上清。 15、每个管中加入30ml 4℃ 70%乙醇，4℃ 12000g（Sorvall SS-34转头为10000r/min）离心10min，小心尽可能移去上清，倒置离心管使沉淀中的残液流尽，用Kimwipes纸巾吸干管颈处。 16、室温放置，使残余乙醇蒸发，用1ml TE（ph8.0）溶解沉淀，-20℃贮存。

17、用分光光度法测定DNA浓度，并用琼脂糖电泳法确定其完整性，将闭合环状DNA分为小份（10-50ug） -20℃贮存。

M13噬菌体特点是：①都能在大肠杆菌中自主复制，而且能连同所带的外源DNA一起复制；②都很容易同细菌DNA分开并加以纯化；③都有一段DNA对于它们自身在细菌中的增殖不是必需的。因此，外源DNA可以插入这一段DNA中，或

是置换这一段DNA而不影响载体的复制。根据这一特点，载体又可分成插入型和置换型两大类。

M13噬菌体 大肠杆菌的m13噬菌体