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基于Wnt通路加味乌梅丸对结肠癌的抑制机制
作者：张然 李素娟 陈正彦 杨坤
来源：《世界睡眠医学杂志》2018年第08期
摘要 目的：探讨加味乌梅丸抑制结肠癌的效果并分析其作用机制。方法：选取BALB/c雄性小鼠30只，随机分为空白组、模型组和乌梅丸组，每组10只。其中空白组小鼠不接受干预措施，乌梅丸组进行乌梅丸煎剂灌胃处理，空白组及模型组接受等剂量生理盐水灌胃，均干预28 d，观察肿瘤体积的变化、小鼠的体重及存活率、肿瘤组织Wnt、JNK水平变化。结果：模型组与乌梅丸组小鼠肿瘤体积较干预前均有增加的趋势，其中乌梅丸组增加的速度较慢，并在干预28 d后肿瘤组织有减小的趋势；干预28 d空白组小鼠体重与初始体重相近，模型组及乌梅丸组小鼠体重明显下降，其中模型组较乌梅丸组下降明显，差异有统计学意义（P 关键词 结肠癌；乌梅丸；肿瘤体积；Wnt蛋白；JNK蛋白；抗肿瘤；侵袭能力；疗效 Abstract Objective：To investigate the colon cancer inhibition of modified wumei boluses and to analyze some of the action mechanism. Methods：A total of 30 BALB/c male mice were randomly divided into blank group， model group and wumei boluses group， with 10 in each group. The mice of blank group did not accept intervention measures， and wumei boluses group had lavage treatment of wumei boluses decoction. Blank group and model group received isodose physiological saline lavage. All the groups had 28 d intervention. The changes of tumor volume， weight of mice and survival rate， concentration changes of Wnt， JNK in the tumor tissue were observed. Results：1）the mice tumor volume increased in the model group and wumei boluses group than before the
intervention， and the increase in the wumei boluses group was more slowly. The tumor tissue had a tendency to decrease after 28 d of intervention. 2）After 28 days of the intervention， the mice weight in the blank group was similar to the initial weight， and the mice weight of the model group and the wumei boluses decreased obviously. The decrease of model group was more significantly than that in the wumei boluses group （P
Key Words Colon cancer； Wumei boluses， Wnt； JNK； Antitumor； Invasiveness； Curative effect
中圖分类号：R289.5；R735.3文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.08.038 结肠癌是临床常见的消化道恶性肿瘤，随着人们生活方式以及饮食结构的改变，结肠癌的发病率日益增加，发病年龄亦有年轻化趋势[1-2]。有研究显示结肠癌从良性病变转变成癌前病变，最终发展成恶性病变过程中Mnt信号通路被异常激活[3]。Mnt信号通路与机体正常胚胎发育密切相关，该通路的标志蛋白相互影响，从而介导相关基因转录，是结肠癌发生的关键因
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素之一，因此，抑制Mnt通路的活化是治疗结肠癌的靶方向。乌梅丸源自《伤寒论》，既往该方被视为此方为止痛安蛔的要方，随着医药研究的逐渐深入，有临床观察显示乌梅丸可明显改善结肠癌患者腹泻、便秘等症状，也有研究人员利用乌梅丸治疗胰腺癌后临床获益理想，生存期得到延长[4]，认为乌梅丸对消化道肿瘤的临床疗效值得肯定。本研究探讨乌梅丸治疗消化道恶性肿瘤的作用机制是否是通过Mnt信号通路进行桥接。我们制备结肠癌动物模型，利用乌梅丸进行干预，通过Western blotting及PCR法对Mnt信号通路上的标志蛋白进行检测，探析乌梅丸治疗结肠癌的作用机制。 材料与方法 1. 材料 1.1. 动物
选取SPF级昆明雄性小鼠30只，体重18～24 g，平均体重（17.26±1.52）g，鼠龄2～4个月，平均鼠龄（2.48±0.36）个月，由本院附属中医药大学实验动物中心提供，并在该动物中心SPF级饲养，饲养温度23～25 ℃，平均饲养温度（14.41±1.41）℃。将30只小鼠随机分为空白组、模型组及乌梅丸组，每组10只。3组小鼠在体重、鼠龄等一般情况比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。 1.1.2 药物
加味乌梅丸，药物组成：乌梅50 g、当归20 g、细辛3 g、川椒6 g、桂枝10 g、黄连3 g、黄柏10 g、党参10 g、干姜10 g、制附片10 g、白芍30 g、生黄芪30 g、炒枳壳10 g、木香10 g。上述中药饮品购自北京华邈中药工程技术开发中心，本院药剂科制备，常规水煎煮后用水浴浓缩并置于4 ℃环境保存备用。 1.1.3 试剂与仪器
10%水合氯醛（天津市光复精细化工研究所），SDS-PAGE电泳胶（北京碧云天生物技术研究所），Trizol（美国Invitrogen公司），逆转录试剂盒（美国Promega公司），-actin、Wnt、JNK一抗和碱性磷酸酶标记山羊抗兔（美国CST公司），PCR引物（上海生工生物工程有限公司），BCA蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、超敏ECL化学发光试剂盒（北京碧云天生物技术研究所），聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美国Millipore公司），RPMI1640完全培养液（美国Hyclone公司），BALB/c小鼠来源的CT26细胞株（韩国he Korean Cell Line Bank）。 1.2 方法
1.2. 分组与模型制备
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将购买的CT26细胞于RPMI1640完全培养液中培养并调整密度为2×103 μ/L，后将CT26细胞注射于小鼠右前腋下部位。空白组小鼠不接受模型制备，当小鼠肿瘤直径4～5 mm时随机分为模型组及乌梅丸组，每组10只[5]。 1.2.2 干预方法
乌梅丸组小鼠予10 mg/（kg·d）乌梅丸汤剂进行灌胃，1次/d。空白组及模型组小鼠接受相同剂量生理盐水进行灌胃，连续灌胃28 d。 1.2.3 检测指标与方法
1）肿瘤体积、体重及存活率的变化：注射前、注射后每隔3 d测量一次肿瘤体积，利用游标尺作为测量工具，以（长×宽2）×2视为肿瘤体积計算公式。小鼠的体重变化率=（当前质量-初始质量）×100%。存活率=（当前小鼠数量/初始小鼠数量）×100%。
2）Western blotting检测肿瘤组织Wnt、JNK的蛋白水平：每组随机选择3只小鼠脱颈处死后，剪取肿瘤组织100 mg置于离心管中，空白组小鼠取相同部位组织相同质量进行观察，根据不同组织质量加入相应的裂解液，放置于4 ℃进行匀浆处理后设置15 000 r/min转速进行离心，用移液枪抽吸上清液，使用BCA试剂盒对25 μL上清液进行蛋白浓度测定，同时计算上样量。完成上述步骤后以4∶1的比例往上清液中样缓冲液，将混合液置于100 ℃金属浴锅中进行蛋白变性7 min。根据碧云天BCA试剂盒说明书配制胶体（6%浓缩胶，12%分离胶），将事先计算好每组上样量将标本加入胶体中60 V进行电145 min后将胶体上的蛋白转印至PVDF膜中，再用丽春红进行PVDF膜染色观察蛋白是否顺利转印至PVDF膜中。用TBST将脱脂奶粉配制成5%浓度，将转印后目的蛋白的PVDF膜进行封闭2 h，随后用TBST进行洗涤3次， min/次。将PCDF膜置于化学发光成像仪上，滴入ECL发光液显影，随后进行数据读取。
3）PCR法检测肿瘤组织Wnt、JNK的mRNA水平变化：每组随机选择3只小鼠脱颈处死后，剪取肿瘤组织100 mg置于离心管中，加用液氮后研磨成碎块，加入 mLTrizol充分反应后按照说明书进行总RNA的提取，并测定总RNA水平，利用PT-RNA两步法的操作说明将mRNA逆转录成cDNA，以该cDNA为扩增模板进行Wnt、JNK、GAPDH指标的扩增。转录过程：5 ℃（6 min）-55 ℃（90 s）-72 ℃（90 s）-72 ℃（10 min）-5 ℃（ h）。具体引物序列参见表1。 1.3 统计学方法
采用SPSS 9.0统计软件进行数据处理。其中呈正态分布的计量数据以均数±标准差（±s）表示，2组比较用t检验，多组采用多因素方差分析，以P 2 结果